斯坦福大学NatNanotech:探测活细胞内吞作用膜曲率

作者: 生物  发布:2019-02-12

  原标题:斯坦福大学Nat. Nanotech.:探测活细胞内吞作用膜曲率的纳米级操作

  细胞膜远不止是细胞外的一层包裹物,还将它们与内吞作用、囊泡形成和蛋白分选等重要功能联系了起来。专门的蛋白能够感知和生成膜曲率,指导膜的重塑。膜弯曲可调节蛋白质活性。迄今为止,膜曲率与蛋白质的结合活性的研究已使用在体外系统中。然而这些研究需要活细胞内吞作用的验证,极具挑战性。至此已有研究表明膜曲率可变,相关的研究还在继续。

  斯坦福大学崔屹教授、崔便晓和David G Drubin(共同通讯作者)研究团队开发了一种用于探测活细胞内吞作用膜曲率的纳米级操作。研究证明可以使用形状垂直排列的纳米柱来控制膜曲率。在这项工作中,他们使用图案化的纳米结构得到范围明确(+50nm~-500nm)曲率半径的膜曲率。最终研究表明在活细胞中,CME蛋白质对高度正曲线的空间偏好超过平坦或负弯曲膜。研究还证实,膜曲率可以直接调节CME的生化活性。这些结果表明除了内吞作用外,膜曲率可能影响许多其他的细胞过程。在活细胞中精确操作膜曲率的能力为研究膜曲率对各种细胞过程的影响开辟了新的途径。相关成果以“Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells”为题,近日发表在Nat. Nanotech.杂志上。

  a)纳米柱示意图:不同半径(灰色)的细胞膜变形产生不同的膜曲率(红线)。

  b)一个700 nm的高梯度纳米柱阵列的SEM图像,中心距间距3μm,半径为500 nm(左)到50 nm(右),具有14 nm的增量。比例尺:10μm。底部:如顶部图像所示,放大单个纳米柱的SEM图像。比例尺:400nm。

  e)用CellMask Deep Red染色的质膜在纳米柱位置增加的膜信号。红色箭头表示具有不同半径的纳米柱的位置。比例尺:10μm。

  f)TEM图:环绕纳米柱的质膜填占网格蛋白涂覆的坑。比例尺,100nm。

  g)用免疫染色的方法显示hCLTAEN/hDNM2EN细胞中网格蛋白和发动蛋白2在纳米柱位置上的积累。在叠加图像中,反转的明场图像被转换为蓝色(右下)。比例尺,5μm。箭头表示具有不同半径的纳米柱的位置。

  h)将32个不同半径纳米柱上的网格蛋白,发动蛋白2和膜信号量化。将相同半径的纳米柱信号平均以获得平均的图像。平均图像从最大(左上角)到最小半径(右下角)排序。显示四个成像通道:明场,网格蛋白,发动蛋白2和脂质双层控制表面积。

  i)CLTA-RFP,DNM2-GFP和脂质膜的强度都随纳米柱半径增加(上)。在膜强度标准化后,当纳米柱半径小于200nm(底部)时,网格蛋白膜和发动蛋白2/膜比率显著增加。每个数据点是超过90-191个纳米柱的平均值,误差代表平均值的标准误差。

  j)从DNM2-GFP的4分钟影片中截取的时间平均的图片显示DNM2-GFP表现出对尖锐的纳米柱的强烈偏好,但在更大半径纳米柱(相同细胞中)的条件下,这种偏好程度将会减弱。比例尺:10μm。

  a)纳米棒(顶部)和纳米字母(底部,C和U)的设计示意图,其用于通过相同的纳米结构来诱导得到一系列曲率,这些曲率的范围在平板膜和高膜曲率(顶部)以及组合正负膜曲率之间。

  b)纳米棒阵列的SEM图像,每个纳米棒宽150nm,长2μm,高1μm,间距5μm(左;比例尺:2μm)。顶部和右下图像中的比例尺:1μm。

  c)在纳米棒阵列上培养SK-MEL-2细胞时,用CellMask Deep Red染色后看出质膜均匀包裹纳米棒。比例尺:2μm。

  d)从4分钟影片中截取的时间平均的荧光图片显示,相比于侧壁,网格蛋白和发动蛋白2更偏好纳米棒的两个高度弯曲的端部。这与c所示的膜染色图像形成鲜明对比。在叠加图像中,纳米棒的明场图像为蓝色。比例尺:5μm。

  e)分散在167个纳米棒上的网格蛋白和发动蛋白2的平均图像。比例尺:2μm。

  f)以胞质为参考的纳米端和纳米棒中心荧光强度的定量值。统计学分析显示纳米棒末端和纳米棒中心之间存在显著差异。

  g)在两个邻近纳米棒上CLTARFP(红)、DNM2-GFP(绿)的波动记录曲线的峰值靠近网格蛋白片段末尾,其特点是网格蛋白介导的内吞作用。一般在纳米端研究动态变化,而不在侧壁之间或纳米棒周围。比例尺:5μM。

  i)用CellMask Deep Red染色纳米CUI阵列上的细胞的图像,其显示细胞膜包裹在纳米C和纳米U结构的内外表面。比例尺:2μm。

  j)从4分钟影片中截取的时间平均的荧光图片显示,网格蛋白和发动蛋白2更偏好纳米C和纳米U的末端和正膜曲率的外表面。比例尺,2μm。

  k)51对纳米C和纳米U上的CLTA-RFP和DNM2-GFP的平均图像清楚地显示了其端部和外表面上的积聚更多。比例尺:2μm。

  l)以胞质作为参考,在纳米C和纳米U结构的末端,外表面和内表面的量化荧光强度。统计学分析显示在末端、外表面与内表面的差异显著。P值如图所示。

  b-o.高倍荧光图像(绿色;比例尺:2μM)显示的是在6个纳米棒中不同蛋白质的分配情况。数百纳米的平均图像和沿纳米棒长度的强度在荧光图中如图所示。

  c)染色剂在纳米棒的整个长度上相对均匀地分布。八种有依赖性内吞作用的网格蛋白成分中含epsin1-GFP。

  e)图像显示出对纳米棒末端的轻微偏好。另一方面,用PH-GFP探测PIP2。

  o)沿整个长度均匀分布的纳米棒是依赖窖蛋白内吞作用的一个重要组成部分,所有的纳米棒长2μm。

  p)通过纳米棒末端与纳米棒中心的归一化强度比,定量得到的纳米棒上14种不同蛋白质/染料的分布情况。对于每一种蛋白质,其分布是对平均值超过56-2,072的纳米棒测量得到的。每个蛋白质与CellMask的统计学意义,通过Welch校正的非配对t检验进行评估。

  a)沿纳米柱线-GFP的波动曲线图显示在纳米柱位置的上发动蛋白2斑点的重复出现和消失(第1行和第3行)。而显示出非常少的DNM2-GFP信号(第2行和第4行)。

  b)DNM2-GFP点的发生频率的空间映射展现纳米柱位置的内吞作用热点。比例尺:5μm。在6分钟内测量了75个纳米柱上的65个发动蛋白2的闪烁。每个纳米柱的面积为1μm2。从同一段影片中,测量了75个平坦区域中62个发动蛋白2的闪烁,每个面积8μm2。将计算膜面积标准化后,纳米柱上弯曲膜上的内吞作用显著高于平膜。柯尔莫可洛夫-斯米洛夫检验的P值0.0001。

  c)纳米柱和平坦区域上的CLTA-RFP和DNM2-GFP点的寿命分布。对于网格蛋白,在纳米柱上测出226个闪烁点,在平坦区域上测出154个闪烁点。对于发动蛋白2,在纳米柱上测出147个闪烁点,在平坦区域上测出260个闪烁点。为了比较纳米柱和平坦区域的差异,柯尔莫可洛夫-斯米洛夫检验给出DNM2-GFP的P值为0.0082,CLTA-RFP的P值为0.0001,差异很大。

  d)与平坦区域相比,纳米柱的CLTA-RFP和DNM2-GFP的平均寿命略低。通过检验,DNM2-GFP与CLTA-RFP所给出P值差异很大。

  专门的蛋白能够感知和生成膜曲率,指导膜的重塑。膜弯曲作为调节蛋白质活性的活跃分子而出现。在研究中由于肌动蛋白及其调节因子参与不同的细胞功能,从而显示出对高度弯曲膜的强烈偏好。这些结果表明除了内吞作用外,膜曲率可能影响许多其他细胞过程。精确操作活细胞膜曲率的能力为研究膜曲率对各种细胞过程的影响开辟了新的途径。

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